PRODUKSI XYLITOL DENGAN YEAST

Xylitol merupakan gula alkohol alami yang saat ini diproduksi secara besar-besaran. Dalam beberapa tahun terakhir biokonversi D-xilosa dari residu lignoselulosa menjadi xylitol, mendapat perhatian besar sebagai prosedur alternatif, karena metode ini memiliki efisiensi tinggi dan mengurangi biaya. Metode bioteknologi untuk memproduksi xylitol ini melibatkan mikroorganisme yang mampu memanfaatkan xilosa.

Mikroorganisme tersebut di antaranya merupakan spesies yeast yang telah terbukti sangat efisien dalam produksi xylitol. Jurnal ini memperlajaro berhubungan dengan beberapa aspek tentang transportasi xilosa dan metabolisme dalam sel yeast, dan faktor-faktor yang dapat mempengaruhi produksi xylitol dan metode untuk meningkatkan biokonversi xylitol.

Pengenalan

Gula alkohol tergolong dalam kelas poliol yang diaplikasi dalam perbaikan karakteristik makanan bergizi. Gula ini mempunyai manfaat dalam dunia kesehatan antara lain rendah kalori, melawan kanker efek dan menurunkan indeks glikemik. Gula alkohol juga mendapat perhatian khusus karena aplikasinya di farmasi, gizi hewan dan produksi kimia. Xylitol secara alami terdapat didalam buah-buahan dan sayuran dan juga dapat diproduksi oleh mikroorganisme seperti yeast dan bakteri. Golongan poliol yang banyak digunakan pada saat ini adalah xylitol.

Industri poliol, termasuk xylitol, diproduksi melalui hidrogenasi kimia gula (seperti D-xylose), yang membutuhkan katalis nikel, serta suhu tinggi dan kondisi tekanan tinggi. Produksi industri tradisional dan  in vitro berbasis enzim tersebut memerlukan biaya agak tinggi, maka metode bioteknologi memproduksi xylitol dengan mikroorganisme semakin diminati. Selama bertahun-tahun metode alternatif ini sangat spesifik dan produksi mikroba dapat dimaksimalkan dengan rekayasa metabolik.

Bioteknologi produksi xylitol

Xylitol adalah gula langka yang terbentuk secara alami dalam jumlah kecil dalam buah-buahan, sayuran, lumut, jamur, dll.  Produksi xylitol skala industri apabila dilakukan kemungkinan dapat digunakan sebagai bahan baku untuk produksi gula langka lainnya. Sebagai contoh xylitol dapat dioksidasi menjadi L-xylulose oleh xylitol-dehidrogenase. Senyawa yang diperoleh menjadi L-lyxose atau L-xylose dengan bantuan L-enzim isomerase rhamnose.  L-xylulose masih dapat diubah menjadi L-ribulosa dan akhirnya dengan L-arabinosa oleh L-arabinosa isomerase.

Bioteknologi produksi xylitol secara ekstensif dipelajari sebagai alternatif metode untuk produksi skala industri dengan memperjelas jalur metabolisme senyawa secara terknologi yang terlibat dalam pertumbuhan mikroba.

Genus yeast dari Candida, Pichia, Debaryomyces, dan Pachysolen mampu menghasilkan xylitol dari D-xylulose melalui reaksi metabolik berturut-turut. Baru-baru ini dibuktikan transportasi xylose dalam Saccharomyces cerevisiae yang dapat tumbuh perlahan dengan menggunakan xylose sebagai sumber karbon tunggal dalam kondisi aerobik. Sampai saat ini, S. cerevisiae dianggap tidak mentransportrasikan  xilosa dan tumbuh buruk lingkungan mengandung xylose. Pada studi awal alternatif melibatkan strain P. stipitis, P. heedii, C. shehatae, dan C. intermedia untuk membuktikan transportasi xylose dalam sel yeast. Sistem transportasi dalam sel yeast ada dua yaitu :

1. Sistem difusi terfasilitasi, dengan afinitas yang rendah. Sistem ini melibatkan gen SUT1 (gula-transporter 1) pada P. stipitis atau GXF1 (glukosa-xilosa fasilitator 1) pada  C. Intermedia.
2. Sistem symport xylose-proton, dengan afinitas tinggi melibatkan kode protein GXS1 (glukosa/symporter xilosa).

Dalam kasus spesies S. cerevisiae, difusi terfasilitasi dari xylose berlangsung dengan bantuan protein transporter yang dikode gen HXT (heksosa transporter). transportasi xylosa dalam sel S. cerevisiae kurang efisien daripada transportasi glukosa, transportasi protein (kode oleh gen XHT2, XHT6, XHT7) mewujudkan afinitas yang lebih tinggi untuk glukosa.

Metabolisme Xylose dalam sel yeast

D-xylose ditransformasikan menjadi xylitol dengan bantuan enzim xylose-reduktase (XR) yang dikodekan oleh XYL1, dengan adanya NADH atau NADPH. Setelah  xylitol diubah menjadi D-Xylulose oleh enzim dehidrogenase xylitol-(XDH) yang dikode gen XYL2, yang dapat digunakan sebagai co-faktor NAD + atau NADP +. Selain itu, S. cerevisiae, dapat dibuat untuk menghasilkan xylitol dari xylose dengan kloning gen XYL1 dari P. stipitis atau C. tropicalis.

Hal ini juga diketahui bahwa yeast memiliki kemampuan yang berbeda untuk memfermentasi xylulose menjadi etanol:

• Dalam kondisi anaerobik, kadar  xylose-reduktase rendah  aktivitas tergantung pada NADH dan / atau NADPH (seperti misalnya P. stipitis) dapat meregenerasi NAD + digunakan dalam reaksi metabolisme kedua. Dalam hal ini produk utama adalah etanol dan tidak ada akumulasi xylitol.
• Dalam kasus strain yeast yang xylose-reduktase tidak dapat digunakan sebagai co-faktor NADH, akumulasi xylitol berlangsung dalam tahap pertama dari jalur metabolisme xylose (misalnya: Debaryomyces hansenii).

Faktor-faktor yang mempengaruhi produksi xylitol dalam yeast. Proses fermentasi yang menghasilkan xylitol dalam yeast dipengaryhu beberapa faktor-faktor yaitu konsentrasi substrat, sumber karbon, inokulum, tingkat aerasi, suhu atau pH.

1. 1.       Xylose Konsentrasi

Itu dibuktikan secara eksperimental bahwa salah satu parameter yang mempengaruhi pertumbuhan yeast dalam proses fermentasi adalah konsentrasi substrat (D-xylose). Konsentrasi xilosa awal dapat mempengaruhi produksi xylitol. Dengan cara ini, dalam kasus mikroorganisme yang dapat tumbuh dalam kondisi tekanan osmotik yang tinggi atau pada  glucides konsentrasi tinggi, konsentrasi xilosa awal yang tinggi dapat menghasilkan jumlah xylitol yang lebih tinggi.

Pada saat yang sama ketika konsentrasi awal  xylose naik, harus dilakukan peningkatan  oksigen, sehingga menghindari penghambatan pertumbuhan mikroba.

studi eksprimen tentang strain C. tropicalis menunjukkan bahwa, pada konsentrasi xilosa tinggi dan dalam tingkat aerasi optimal, pertumbuhan sel yang signifikan terjadi pada awal proses fermentasi dan tingkat produksi xylitol sangat meningkat.

1. 2.       Sumber Karbon

Itu dibuktikan secara eksperimental bahwa, dalam kasus C. tropicalis, penggunaan D-glukosa sebagai substrat dalam konsentrasi rendah, mengarah dalam efisiensi produksi. Efek ini dapat dijelaskan oleh fakta bahwa D-glukosa digunakan dalam pertumbuhan sel, D-xylose yang dikonsumsi setelah pertumbuhan. Pengaruh faktor ini juga terbukti menjadi spesifik untuk spesies tertentu, karena hasil yang serupa belum dikonfirmasi dalam kasus lain, seperti C. guilliermondii.

1. 3.       Sumber Nitrogen

Di antara sumber nitrogen, ekstrak yeast dan urea merupakan nutrisi yang disukai oleh yeast untuk memproduksi xylitol. sumber nitrogen memberikan efek stimulasi telah dibuktikan oleh penelitian pada beberapa strain C. boidinii.

1. 4.       Konsentrasi dan inokulum usia

Proses fermentasi dapat dipengaruhi juga oleh umur inokulum, ini mempengaruhi aktivitas metabolisme dan kelangsungan hidup sel. Sebuah perbaikan produksi xylitol oleh C. guilliermondii (0.75gl -1 h-1), mulai dari inokulum 24h dan konsentrasi awal xylose  54,5 gl 1 eksperimental berhasil.

1. 5.       Kondisi Aerobik

Oksigen merupakan faktor penting dalam degradasi xylose oleh yeast. Hal ini telah dibuktikan bahwa dalam kondisi anaerobik total, benar-benar menghentikan jalur metabolisme yang menghasilkan xylitol dari xylose. Tingkat oksigen yang dibutuhkan untuk metabolisme xylose juga merupakan komponen spesifik untuk setiap spesies. Sebagai contoh, C. tropicalis menunjukkan maksimum produktivitas di semi-anaerob kondisi, hasil serupa yang dikonfirmasi juga ketika menggunakan D. hansenii strain (4-22 mmol l -1 min-1).

1. 6.       Suhu dan pH

Suhu optimal eksperimental telah ditemukan berada di sekitar nilai 30°C, dengan variasi kecil tidak secara signifikan mempengaruhi konsentrasi xylitol yang akan dihasilkan. Namun, ketika sel-sel yang tumbuh pada suhu luar 37°C, produktivitas mengalami penurunan drastis. Nilai pH awal yang digunakan selama proses fermentasi dipilih berdasarkan pada spesies yang digunakan. PH optimal untuk D. hansenii adalah 5,5, sedangkan untuk C. parapsilosis, C. guilliemondii dan C. boidinii nilai-nilai 4,5-5, 6.0, dan 7.0 masing-masing.

Metode untuk meningkatkan produksi xylitol oleh yeast

Kemampuan untuk mendapatkan xylitol sebagai produk metabolisme normal terbukti untuk berbagai spesies yeast, terutama milik genus Candida (C.boidinii, C.guilliermondii, C.parapsilosis,, C.pelliculosa, C.shehatae, C.tropicalis dan terkait spesies Debaryomyces hansenii dan stipitis Pichia. Meskipun yeast yang paling aktif sehingga paling berguna dalam produksi xylitol, masalah pada skala industri karena harga untuk D-xylose mahal sehingga biaya produksi tinggi. Ini dapat dikalahkan dengan menerapkan metode untuk mengoptimalkan proses produksi, melibatkan memodifikasi kondisi pertumbuhan, mengendalikan oksigen terlarut  dan potensial redoks, menggunakan co-substrat tertentu atau memodifikasi enzim yang berhubungan kegiatan dengan menghalangi ekspresi gen XYL2 dan dengan demikian meningkatkan aktivitas xylose-reduktase .

Metode perbaikan yang dijelaskan sampai sekarang didasarkan pada:

1. Kimia (dengan ethylmetansulphonate-EMS) dan fisik (dengan radiasi ultraviolet) teknik mutagenesis. Jumlah produksi xylitol dari mutan dapat dinaikkan, dalam hal ini dengan mengikuti dengan percobaan dengan N-metil-N-nitro-N nitrosoguanidine (MNNG). Pemilihan mutan menarik dilakukan, dalam kedua kasus, dengan menanam lebih satu pada media tertentu.
2. 2.       Rekayasa genetika teknik

Sampai saat ini, telah digambarkan tiga kategori strain yeast yang dapat memproduksi xylitol.

1. Strain liar yang dapat mengasimilasi (memerlukan energi) xilosa dengan produksi xylitol (misalnya: C boidinii, C. guilliermondii, C. tropicalis, C.parapsilosis, D. hansenii)
2. Yeast strain (misalnya: P.stipitis) yang dapat mengkonversi xylose dalam xylitol karena gangguan pada tingkat gen yang kode untuk alkohol dehidrogenase (ADH), atau xilitol-dehidrogenase (XDH)
3. Direkombinasi yeast strain S. cerevisiae seperti yang menyajikan gen XYL1 dari P. stipitis. (Ying YS, 2005) atau C. tropicalis menyajikan XYL1 gen dari C. parapsilosis.

Menurut Koo (2003) untuk mengoptimalkan produksi xylitol pada C. tropicalis dapat diperoleh dengan menghalangi transformasi metabolik xylitol di D-xylulose sebagai akibat dari gangguan genetik di tingkat XYL2 gen. Dengan menambahkan co-substrat (yang paling efisien terbukti menjadi gliserol) yang diperlukan untuk pertumbuhan sel dan regenerasi NADPH, konsentrasi akhir yang diperoleh adalah xylitol 48,6 g / l pada 16h.

Strategi ini juga berhasil digunakan dalam kasus spesies yeast lainnya seperti P. stipitis. Mutan rusak dalam sintesis XDH, diperoleh melalui gangguan dari gen XYL3 pengkodean untuk D-xylulokinase, dapat menyebabkan akumulasi xylitol (26g / l) di media.

Sumber :

RALUCA  GHINDEA, ORTANSA  CSUTAK,ILEANA  STOICA,ANA-MARIA TANASE, TATIANA VASSU . University of Bucharest, Faculty of Biology, Department of Genetics, 1-3 Aleea  Portocalilor, sector 5, 060101 – Bucharest, Romania